qRT-PCR

原理（分两步）

第一步：RT（逆转录）——把mRNA变成DNA

为什么要这一步？因为mRNA非常不稳定（容易被RNase降解），而且PCR技术只能扩增DNA。所以需要先用一种叫逆转录酶的工具，以mRNA为模板合成一条互补的DNA（叫cDNA）。

mRNA → [逆转录酶] → cDNA（稳定，可以用PCR扩增）

第二步：qPCR（定量PCR）——测cDNA有多少

PCR（聚合酶链式反应）的本质是DNA复制的体外模拟：

第1轮：1个DNA分子 → 2个
第2轮：2个 → 4个
第3轮：4个 → 8个
...
第30轮：约10亿个

每一轮复制需要三个条件：

• 模板：你要扩增的cDNA
• 引物（primers）：两条短的DNA片段，像"书签"一样标记你要扩增的基因片段的起点和终点。每个基因需要设计专门的引物对——这就是为什么qRT-PCR是"查单个基因"的方法
• DNA聚合酶：负责合成新DNA链的"工人"（耐热的Taq酶）

"q"（quantitative）是怎么做到"定量"的？

在每轮扩增中，加入一种荧光染料，它会结合到新合成的DNA上发出荧光。DNA越多 → 荧光越强。仪器实时监测荧光强度，记录荧光信号达到某个阈值时经过了多少轮（这个轮数叫Ct值）。

• 如果一个基因在样本中表达量很高（mRNA多 → cDNA多 → 起始模板多）→ 用更少的扩增轮数就能达到阈值 → Ct值小
• 如果表达量很低 → 需要更多轮才能达到阈值 → Ct值大